7月中旬，中共中央决定对大革命失败负有直接责任的陈独秀停职，成立了由张国焘、李维汉、周恩来、张太雷、李立三五人组成的中央临时政治局常务委员会。中央临时政治局并决定举行南昌起义和秋收起义。
7月23日下午，恽代英、廖乾吾等根据党的指示，到达九江。
接着，周恩来在陈赓的陪同下，也从武汉到九江，又召集在九江的负责同志举行会义。
会议一致同意：在政治上决定组织中国国民党革命委员会为集中政权、党权、军权之最高机关，以反对宁汉政府中央党部，继承国民党正统，没收大地主土地，实现劳动保护法为暴动之目的。
会后，周恩来、李立三等立即奔赴南昌，遵照中央命令，在江西大旅社内正式成立了党的前敌委员会，由周恩来，李立三、恽代英、彭湃组成，负责指挥前敌一切事宜。会议还决定将原来在九江提出的28日晚举行起义的计划改为30日晚。
不料，27日晨，张国焘也赶到九江，很快召集恽代英、廖乾吾、高语罕、贺昌、夏曦等举行会议。他说，中央认为南昌暴动困难重重，应重新考虑，并说这是共产国际的指示。
几个人都回答：暴动已势在必行，没有重新考虑的余地。恽代英的情绪更为激昂。他说：“国际的错误和陈独秀的错误害死了中国的革命，葬送了成千上万的同志。它们的领导已完全破产了，现在南昌暴动已经一切都准备好了，忽然又来了什么国际指示，阻止我们的行动，我是誓死反对的。如果你再动摇人心，我们就要打倒你！”
29日半夜，廖乾吾从外面回来，带来叶剑英参谋长的通知：汪精卫、唐生智已下密令，要辑拿恽代英、高语罕和廖乾吾等四人。恽、高、廖三人连夜离开九江去南昌。
8月1日凌晨，一声响亮的枪声，向世界宣告：由中国共产党领导的南昌起义开始了。
起义军经过激烈的战斗，到清晨6时，歼敌3000多人，缴枪5000多支，肃清城内全部敌军，起义取得了胜利。
上午，在原江西省政府召开有中国共产党人和国民党左派的联席会议，选举产生了由25名委员组成的中国国民党革命委员会，恽代英当选为委员，并是七个组成的主席团成员之一。革命委员会下设七个办事机构，恽代英任财政委员会委员、宣传委员会代理主席（主席郭沫若，8月5日才赶到南昌）。
当天，在南昌《民国日报》上公布了事前早已准备好的《中央委员宣言》，由宋庆龄、谭平山、恽代英等22人署名。宣言回顾了国民党反动派先后背叛革命的经过，揭露蒋介石“公然叛变，割据东南，勾结军阀买办，残害同志，屠杀民众”等罪行。
南昌起义胜利后，前敌委员会按照中央预先作出的决定：部队立即南下，占领广东，取得海口，以求得到援助，再举行第二次北伐。8月3日，起义军开始分批撤离南昌，沿着周恩来提出的由赣南经寻邬，直取东江的路线，向广东进军。
10月，中央又决定，由周恩来、张太雷、恽代英等六人组成南方局，负责领导广东、广西、闽南等地党的工作。
南征路上，困难和挫折接踵而来，令人意想不到。蔡廷锴部队的叛逃，拉走了全军将近四分之一兵力。特别是江西的8月份正是酷暑难耐的季节，起义军走的又是山路，每人身背二三百发子弹，还是自扛机枪、大炮。沿途老百姓由于反动派的造谣，大多逃离，使部队的供给极其困难。许多战士病倒。军行三日，人困马乏，实力损耗近三分之一。
恽代英作为宣传委员会的主要负责人，分配到了一匹马，但他总是把马让给有病的或体弱的同志骑，自己扛着背包、拿着雨伞，和战士们一起步行。当战士们看到他光着头，赤着脚，在酷烈的太阳下步行，换洗衣服都丢掉了，身上穿的一套粗布军衣已污秽破烂不堪，肩上搭着一条“万能”的长布手巾，身上晒脱了皮，又黑又瘦，都大受感动，不少人惊叹：“瞧！那些大委员们，双我们更能吃苦。”大家的精神也就振作起来了。
部队一停一来，就忙着弄饭吃，休息，准备第二天的行军。可是恽代英没有时间休息，他还要忙着做许多政治思想教育和宣传工作。他要向士兵们进行革命教育，向群众进行革命宣传，要大家懂得：为什么要举行南昌起义？起义的目的是什么？任务是什么？任务是什么？怎样解决群众关心的问题等等。
起义军在抚州、广昌、瑞金、长汀、上杭、汕头等停留时间较长的城市里，都召开了群众集会，每次都有恽代英的讲话。他向渴求解放的群众分析国内政治形势，解释革命军的目的和政策。在南征途中，他是对人民群众进行艰苦的政治宣传和教育工作扩要组织者和领导者。
起义军终因寡不敌众而失败。大部分领导人在当地党组织和农民协会掩护、帮助下，分别出海转赴香港。重病中的周恩来由一条小船走后，恽代英也从甲子港去了香港。